晶體-細(xì)胞互相功效的蛋白質(zhì)組學(xué)：腎結(jié)石研發(fā)的模型

Thongboonkerd V. Proteomics of Crystal-Cell Interactions: A Model for Kidney Stone Research. Cells. 2019 Sep 12;8(9):1076. doi: 10.3390/cells8091076. PMID: 31547429; PMCID: PMC6769877.

晶體-細(xì)胞互相功效的蛋白質(zhì)組學(xué)：腎結(jié)石研發(fā)的模型

腎結(jié)石/尿石癥（即腎結(jié)石病）仍舊是1個世界公共衛(wèi)生問題，發(fā)病率/抱病率不停升高。腎結(jié)石最常見的化學(xué)成份是草酸鈣，它通過結(jié)晶、晶體生長、晶體集結(jié)、晶體細(xì)胞粘擁護(hù)通過腎間質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)侵入來激發(fā)結(jié)石生成。在這類流程中，晶體 - 細(xì)胞互相功效（定論為“細(xì)胞通過粘附在細(xì)胞外表或內(nèi)化到細(xì)胞中的晶體的任意方法的牽連而變化細(xì)胞的情況，隨同著晶體的改變，比如，細(xì)胞誘導(dǎo)的生長，粘合本領(lǐng)，降解等”）針對晶體在腎臟中的保留十分首要。在過去的12年中，蛋白質(zhì)組學(xué)已全面運(yùn)用于腎結(jié)石研發(fā)，旨在更好地了解腎結(jié)石生成的致病體制。本文概括了該行業(yè)的當(dāng)下常識，并總結(jié)了從一切將蛋白質(zhì)組學(xué)運(yùn)用于晶體 - 細(xì)胞互相功效研發(fā)的研發(fā)中獲取的信息，這類研發(fā)隨后造成了性能研發(fā)，以處理表示蛋白質(zhì)組學(xué)信息在腎結(jié)石重病發(fā)病體制中的顯著牽連或性能功效。

1. 引言

腎結(jié)石病仍舊是一類常見的人類重病，在世界發(fā)達(dá)國度和成長中國度都能夠搜到[1，2，3]。腎結(jié)石首要由含鈣晶體構(gòu)成，特別是草酸鈣（CaOx）一水合物（COM）和二水合鈣（COD）[1，2，3]。腎結(jié)石生成的體制流程相當(dāng)高難，牽扯結(jié)晶、晶體生長、晶體集結(jié)、晶體細(xì)胞粘附并且通過腎間質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）侵入晶體[4，5，6]。結(jié)晶既能夠在腎小管內(nèi)（管內(nèi)模型）內(nèi)產(chǎn)生，也能夠產(chǎn)生在腎間質(zhì)（蘭德爾斑塊模型）[4，5，6]。晶體生成后，單個晶體通過晶體生長或集結(jié)體制變成較大的顆粒[7，8]。另外，晶體-細(xì)胞粘附造成晶體潴留到腎小管或間質(zhì)內(nèi)[9，10]。粘附的晶體能夠內(nèi)化到腎小管細(xì)胞中進(jìn)行降解，反之亦然，通過炎癥級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)結(jié)石生成流程[11，12]。最終，在腎間質(zhì)中生成的內(nèi)化晶體能夠應(yīng)用纖溶酶-纖溶酶原途徑[13]通過ECM侵入或遷移到其余部位，隨后激發(fā)組織炎癥和腐蝕[14，15]。

有趣的是，晶體保留和結(jié)石生成的要害流程之一是晶體 - 細(xì)胞粘附方法，須要“晶體 - 細(xì)胞互相功效”，這能夠在這里定論為細(xì)胞被粘附在細(xì)胞外表或內(nèi)化到細(xì)胞中的晶體的任意牽連而變化的情況， 隨同著晶體的改變，比如，細(xì)胞誘導(dǎo)的生長、粘合本領(lǐng)、降解等。應(yīng)用術(shù)語“互相功效”是通過晶體和細(xì)胞之間的“互相功效”來邏輯的。很顯著，晶體能夠引發(fā)細(xì)胞中的不少改變，從輕度到重度細(xì)胞毒性[14，15，16]。另一方面，細(xì)胞的構(gòu)成，特別是在頂端外表和內(nèi)吞囊泡中，會牽連晶體的生長，粘合本領(lǐng)和降解[17，18]。這類互相功效能夠加強(qiáng)腎內(nèi)晶體的保留和晶體加入腎小管細(xì)胞的內(nèi)吞功效。另外，晶體-細(xì)胞互相功效也可造成腎小管細(xì)胞傷害和炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而進(jìn)一步加強(qiáng)結(jié)石生成流程[14，15，16]。

在蛋白質(zhì)組學(xué)世紀(jì)，蛋白質(zhì)組學(xué)已被全面運(yùn)用于各類腎臟重病[19，20，21]。在過去的12年中，蛋白質(zhì)組學(xué)已全面運(yùn)用于腎結(jié)石重?。ㄌ貏e是COM和COD型號）的研發(fā)，旨在更好地了解腎結(jié)石生成的致病體制[22，23]。本文總結(jié)了一切將蛋白質(zhì)組學(xué)運(yùn)用于晶體 - 細(xì)胞互相功效研發(fā)的研發(fā)，這類研發(fā)隨后造成了性能研發(fā)，以處理表示蛋白質(zhì)組學(xué)信息在腎結(jié)石重病發(fā)病體制中的顯著牽連或性能功效。請注重，這類研發(fā)運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)從結(jié)石生成者中判定尿液或腎結(jié)石基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，而沒有任意證據(jù)標(biāo)明“晶體 - 細(xì)胞互相功效”（見上面的定論），被消除在本評估之外（由于此中不少蛋白質(zhì)不過與尿液中的結(jié)石調(diào)整劑混合，或者不過在結(jié)石腫大時期通過窒礙卡在結(jié)石基質(zhì)內(nèi)，但在結(jié)石發(fā)病體制中沒有任意功效）。腎結(jié)石研發(fā)中與CaOx晶體 - 細(xì)胞互相功效的蛋白質(zhì)組學(xué)有關(guān)的一切有關(guān)研發(fā)總結(jié)在表 1并研討如下。

表 1 與CaOx晶體 - 細(xì)胞互相功效的蛋白質(zhì)組學(xué)有關(guān)的一切有關(guān)研發(fā)摘要。年作家/考慮文獻(xiàn)晶體-細(xì)胞互相功效的前提蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)/性能探測首要發(fā)掘不同劑量和型號的CaOx晶體對腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的牽連2008塞曼戈恩等 [24]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞 （全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COM養(yǎng)成：48 小時2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜11種上浮和5種下調(diào)蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)錄/翻譯，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞代謝和生長，核和細(xì)胞構(gòu)造，運(yùn)輸，應(yīng)激反應(yīng)和生物合成中闡揚(yáng)功效。2008通布克德五世等 [25]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：1000 μg/mL COM 孵育：48 小時2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜判定出25種上浮和23種下調(diào)蛋白質(zhì)。當(dāng)伴侶被上浮時，參加蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞周期調(diào)整，細(xì)胞構(gòu)造和細(xì)胞信號傳導(dǎo)的其余蛋白質(zhì)被下調(diào)。2008塞曼戈恩T等[26]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COD孵育：48 小時2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜5種上浮和5種下調(diào)蛋白質(zhì)，操控細(xì)胞代謝，構(gòu)造，完好性，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)。2010陳 S 等 [27]]細(xì)胞：HK-2 細(xì)胞 （全細(xì)胞）晶體：200 μg/mL COM養(yǎng)成：12 小時2-DE 銀二胺染色， LC-靜電放電微粒/微粒9種上浮和3種下調(diào)蛋白質(zhì)，在能量構(gòu)成，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，應(yīng)激反應(yīng)，鈣平衡和蛋白質(zhì)合成中起功效。2011蔣宗華等 [28]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COD孵育：48 小時2-DE、Pro-Q 祖母綠糖蛋白染色、西普羅紅寶石總蛋白染色、Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜在16種明顯變化的糖蛋白中，3個蛋白酶體亞基的糖型上浮，而肌動蛋白有關(guān)蛋白3（ARP3）的糖型下調(diào)。2012柴亞里特 S 等 [29]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（純化的線粒體）晶體：100微克/毫升COM孵育：48小時2-DE，深紫色染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜，氧合分印跡測定12種上浮和3種下調(diào)線粒體蛋白，調(diào)整細(xì)胞構(gòu)造，新陳代謝和能量構(gòu)成。COM晶體還誘導(dǎo)線粒體性能阻礙和氧化潤飾蛋白在細(xì)胞中的沉淀。2017維奈法特A等 [30]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞 （全細(xì)胞）晶體：100/1000 μg/mL COD/COM養(yǎng)成：48 小時蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相功效網(wǎng)絡(luò)解析，熒光素 - 熒光素酶ATP測定，氧化印跡測定，泛素化蛋白質(zhì)的丈量，細(xì)胞滅亡測定和晶體 - 細(xì)胞粘附測定與低劑量相比，高劑量的這類晶體引發(fā)細(xì)胞蛋白質(zhì)組更顯著的改變，以及COM比COD更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化。用高劑量解決的細(xì)胞擁有更高程度的細(xì)胞內(nèi)ATP，氧化潤飾蛋白和細(xì)胞滅亡，但泛素化蛋白程度過低。COM也誘發(fā)比COD更嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。用抗氧化劑EGCG對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)解決能夠減低晶體誘導(dǎo)的氧化潤飾蛋白的沉淀和細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)。2018皮拉彭 P 等 [31]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：1000 μg/mL COM 孵育：48 小時蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相功效網(wǎng)絡(luò)解析、增殖測定、傷口愈合測定、氧化印跡測定、熒光素-熒光素酶 ATP 測定和經(jīng)上皮耐藥性 （TER） 丈量用1000μg/ mL COM晶體解決的細(xì)胞毒性細(xì)胞在細(xì)胞增殖，傷口愈合本領(lǐng)，TER并且慎密連通蛋白zonula閉塞-1（ZO-1）和信號蛋白RhoA的程度方面存在減低。相同，細(xì)胞內(nèi)ATP和氧化潤飾蛋白的程度上升。腎小管細(xì)胞頂端外表COM晶體受體的蛋白質(zhì)組判定2011方恩根等 [32]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞 （純化的頂端膜）晶體：COM孵育：過夜甲基纖維素/質(zhì)譜、Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜、晶體細(xì)胞粘附測定、抗體中和測定共判定出96個潛在的COM晶體受體。膜聯(lián)蛋白II成為COM晶體受體的功效通過應(yīng)用特同性抗體的中和測定獲得證明。2012舒替蓬坦酸 S 等 [33]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM孵育：30分鐘，72小時2-DE、西普魯比紅寶石染色、Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜解析、晶體-細(xì)胞粘附測定、鈣誘導(dǎo)測定、抗體中和測定膜聯(lián)蛋白A1成為COM晶體受體。2013坎拉亞 R 等 [34]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM養(yǎng)成：30分鐘，72小時2-DE、西普羅紅寶石染色、Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜、晶體細(xì)胞粘附測定、草酸鹽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、抗體中和測定A-烯醇化酶成為COM晶體受體。2016皮拉彭 P 等 [35]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM孵育：30分鐘晶體-細(xì)胞粘附測定、鈣誘導(dǎo)測定膜聯(lián)蛋白A1成為COM晶體受體。2016方恩根等 [36]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全部細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM孵育：1小時晶體細(xì)胞粘附測定、抗體中和測定A-烯醇化酶成為COM晶體受體。2016方恩根等 [37]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM養(yǎng)成：1小時，48小時晶體-細(xì)胞粘附測定、晶體內(nèi)化測定、抗體中和測定、小煩擾RNA（siRNA）敲低蛋白質(zhì)HSP90用作COM晶體受體。2016馬尼索恩 J 等 [38]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM孵育：30分鐘晶體-細(xì)胞粘附測定、蛋白質(zhì)過表示、草酸鹽誘導(dǎo)測定A-微管蛋白過表示造成三類COM晶體受體的下調(diào)，含蓋α烯醇化酶，HSP70和HSP90，并減低了細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)。2016彭薩庫爾 N 等 [39]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COM孵育：30 分鐘晶體-細(xì)胞粘附測定、siRNA 蛋白質(zhì)敲低、草酸鹽誘導(dǎo)測定層粘連蛋白A / C敲低造成四種COM晶體受體的程度減低，含蓋維生素A，α烯醇化酶，S100和膜聯(lián)蛋白A2，以及細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)下落。2018馬尼索恩 J 等 [40]]細(xì)胞：HEK293T 細(xì)胞 （全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COM養(yǎng)成：1 小時晶體-細(xì)胞粘附測定，通過siRNA敲低蛋白質(zhì)HSP90用作COM晶體受體。2018維奈法特A等 [41]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全部細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM孵育：1小時晶體-細(xì)胞粘附測定、晶體內(nèi)化測定、抗體中和測定PMCA2用作COM晶體受體。COM晶體對單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的牽連2010辛格托N等[42]細(xì)胞：U937 細(xì)胞 （全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COM養(yǎng)成：24 小時2-DE，深紫色染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜9種上浮蛋白質(zhì)和13種下調(diào)蛋白質(zhì)，在細(xì)胞周期，細(xì)胞構(gòu)造，碳水化合物代謝，脂質(zhì)代謝，mRNA加工并且蛋白質(zhì)合成，安穩(wěn)和降解中起功效。2013辛格托N等[43]]細(xì)胞：人巨噬細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：100μg/mL COM孵育：24小時2-DE，深紫色染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜，吞噬功效測定，通過 SIRNA 敲低蛋白質(zhì)7種上浮和7種下調(diào)蛋白質(zhì)，操控細(xì)胞構(gòu)造，碳水化合物代謝，DNA / RNA加工，蛋白質(zhì)代謝，分子運(yùn)輸和應(yīng)激反應(yīng)。HSP90在巨噬細(xì)胞的吞噬體生成和吞噬活性中起著至關(guān)首要的功效。COM晶體對排泄組和外泌體蛋白質(zhì)組的牽連2016蔣宗華等 [13]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（排泄組）晶體：100 μg/mL COM養(yǎng)成：20 小時2-DE，深紫色染色，Q-TOF MS / MS，晶體遷移測定，細(xì)胞遷移測定COM晶體誘導(dǎo)2個來自腎小管細(xì)胞的排泄蛋白加大和4個減小。排泄性烯醇化酶-1的加大反過來又通過ECM加強(qiáng)了COM晶體的侵入。2016辛提普倫格拉特 K 等 [44]]細(xì)胞：U937 細(xì)胞（排泄組）晶體：100 μg/mL COM孵育：16 小時2-DE，深紫色染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜COM晶體誘導(dǎo)了14個與U937單核細(xì)胞免疫反應(yīng)和細(xì)胞存活有關(guān)的排泄蛋白加大和4個減小。加大的HSP90限于于細(xì)胞外表。2018辛格托N等[45]細(xì)胞：人巨噬細(xì)胞（外泌體）晶體：100 μg/mL COM孵育：24小時2-DE，深紫色染色，納米LC-ESI-ETD MS / MS，細(xì)胞遷移測定，吞噬功效測定，通過siRNA敲低蛋白質(zhì)2種上浮和4種下調(diào)外泌體蛋白。來自晶體互相功效的巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移/活化和巨噬細(xì)胞的吞噬活性。siRNA敲低了維生素素，順利地抑止了來自COM晶體表露巨噬細(xì)胞的外泌體的這類功效。2018辛格托N等[46]細(xì)胞：人巨噬細(xì)胞（外泌體）晶體：100 μg/mL COM孵育：24小時納米LC-ESI-Qq-TOF，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，晶體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，晶體遷移實(shí)驗(yàn)7種上浮和19種下調(diào)外泌體蛋白。來自晶體互相功效巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移，加強(qiáng)腎小管細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-8的構(gòu)成，與COM晶體擁有更大的結(jié)合本領(lǐng)，并通過ECM激活晶體入侵。

2. 不同劑量和型號的CaOx晶體對腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的牽連

運(yùn)用于晶體 - 細(xì)胞互相功效的蛋白質(zhì)組學(xué)的初次研發(fā)是在2008年完結(jié)的[24]。在這項(xiàng)工作中，認(rèn)真創(chuàng)建了研發(fā)模型，標(biāo)明劑量為100μg/ mL（每體積養(yǎng)成基）的COM晶體在48小時的埋伏期不會對腎小管細(xì)胞導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，以及細(xì)胞滅亡百分比不會加大。因而，由COM晶體誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變反映了細(xì)胞對COM晶體的反應(yīng)，而不是它們的細(xì)胞毒性功效。另外，掃描電子顯微鏡（SEM）在與細(xì)胞孵育后顯現(xiàn)出COM晶體邊緣的變形，初次標(biāo)明晶體 - 細(xì)胞互相功效擁有直接的試驗(yàn)證據(jù)。應(yīng)用二維凝膠電泳（2-DE）與Sypro Ruby熒光染色，接著進(jìn)行四極桿飛翔時間（Q-TOF）質(zhì)譜（MS）和串聯(lián)MS（MS / MS），判定了11種上浮和5種下調(diào)蛋白質(zhì)，它們在轉(zhuǎn)錄/翻譯，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞代謝和生長，核和細(xì)胞構(gòu)造，運(yùn)輸，應(yīng)激反應(yīng)和生物合成中起功效。此中許多蛋白質(zhì)組學(xué)信息通過二維（2-D）蛋白質(zhì)印跡獲得證明[24]。

隨后，進(jìn)行了一項(xiàng)亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研發(fā)[29]，以評價(jià)100μg/mL COM晶體對線粒體蛋白質(zhì)組的牽連并且應(yīng)用高度純化的線粒體分離方式表露于晶體48小時的腎小管細(xì)胞的性能[47]。應(yīng)用2-DE與深紫色熒光染色的較為解析，接著是Q-TOF MS和MS / MS解析，確認(rèn)了12種上浮和3種下調(diào)線粒體蛋白，它們調(diào)整細(xì)胞構(gòu)造，代謝和能量構(gòu)成。另外，Oxyblot探測標(biāo)明，COM晶體誘導(dǎo)線粒體性能阻礙和氧化潤飾蛋白在細(xì)胞中的沉淀[29]。

另一項(xiàng)應(yīng)用很高劑量（200 μg/mL）COM晶體的研發(fā)顯現(xiàn)，當(dāng)腎小管細(xì)胞與COM晶體和2 mM草酸鹽一塊孵育較短時間（僅12小時）時，細(xì)胞滅亡不會加大[27]。應(yīng)用2-DE銀染色，接著液相色譜法結(jié)合電噴霧電離MS / MS（LC-ESI MS / MS），信息顯現(xiàn)9種上浮和3種下調(diào)細(xì)胞蛋白，其功效于能量構(gòu)成，細(xì)胞增殖，凋亡，應(yīng)激反應(yīng)，鈣平衡和蛋白質(zhì)合成。

應(yīng)用高得多劑量（1000 μg/mL）的COM晶體，細(xì)胞在與晶體孵育48小時后，細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重細(xì)胞毒性，總細(xì)胞滅亡加大[25]。應(yīng)用2-DE與西普羅紅寶石染色，接著進(jìn)行Q-TOF MS和MS / MS解析，判定出25種上浮和23種下調(diào)蛋白。EZRIN、烯醇化酶-1和膜聯(lián)蛋白-A1程度的減低通過2-D蛋白質(zhì)印跡獲得證明。有趣的是，伴侶被上浮，而其余參加蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞構(gòu)造和細(xì)胞信號傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)被下調(diào)[25]。較近應(yīng)用各類測定方式進(jìn)行了性能研發(fā)，以確認(rèn)該表示蛋白質(zhì)組學(xué)信息集的生物學(xué)有關(guān)性[31]。最初，一切顯著變化的蛋白質(zhì)被提交達(dá)STRING生物數(shù)據(jù)學(xué)工具[48]以獲取蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)互相功效網(wǎng)絡(luò)，其揭露了細(xì)胞增殖/傷口愈合，氧化應(yīng)激/線粒體性能并且細(xì)胞連通復(fù)合物/完好性是顯著變化蛋白質(zhì)的首要生物學(xué)性能。驗(yàn)證明驗(yàn)標(biāo)明，用1000 μg/mL COM晶體解決的細(xì)胞毒性腎小管細(xì)胞在細(xì)胞增殖、傷口愈合本領(lǐng)、經(jīng)上皮阻力（TER）并且閉塞-1（ZO-1）和信號蛋白RhoA的慎密連通蛋白程度方面均有所下落。相同，氧化潤飾蛋白的程度上升。固然ATP合酶α亞基前體減小，但參加能量構(gòu)成和穩(wěn)態(tài)的其余線粒體蛋白（比如烏頭酶、腺苷酸激酶2、泛醇-細(xì)胞色素-c復(fù)原酶）加大[25]。結(jié)果，COM解決的細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)ATP程度上升[31]。這類信息也許反映了COM晶體誘導(dǎo)的微管毒性時期產(chǎn)生的細(xì)胞流程[31]。

蛋白質(zhì)組學(xué)還運(yùn)用于研發(fā)表露于無毒劑量（100μg/mL）的COD晶體48小時后腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變[26]。應(yīng)用2-DE和Sypro Ruby染色，接著進(jìn)行Q-TOF MS和MS/MS解析，信息顯現(xiàn)5種上浮和5種下調(diào)蛋白質(zhì)操控細(xì)胞代謝、構(gòu)造、完好性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)[26]。隨后，研發(fā)了100 μg/mL COD晶體誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞糖蛋白組的改變[28]。應(yīng)用2-DE和Pro-Q祖母綠糖蛋白染色，接著應(yīng)用Sypro Ruby總蛋白染色進(jìn)行歸一化，Q-TOF MS和MS / MS判定了16個顯著變化的糖蛋白，含蓋負(fù)擔(dān)調(diào)整細(xì)胞 - 細(xì)胞解離的3個蛋白酶體亞基的糖型和在細(xì)胞完好性中起功效的肌動蛋白有關(guān)蛋白3（ARP3）。這類信息標(biāo)明，COD晶體造成細(xì)胞解離并減低細(xì)胞完好性[28]。

另外，還對表露于不同劑量和型號的CaOx晶體后腎小管細(xì)胞的性能擾動進(jìn)行了較為解析[30]。表示信息的較為標(biāo)明，與低劑量相比，這類晶體的高劑量引發(fā)細(xì)胞蛋白質(zhì)組更顯著的改變，以及COM比COD更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化。性能解析顯現(xiàn)，在用高劑量COM和COD解決的細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)ATP，氧化潤飾蛋白和細(xì)胞滅亡程度很高，但泛素化蛋白程度過低。COM晶體也誘導(dǎo)比COD更嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。用抗氧化劑表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)解決能夠減低晶體誘導(dǎo)的氧化潤飾蛋白的沉淀和細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)。這類信息注重了高劑量與低劑量并且COM與COD晶體在腎小管細(xì)胞中誘導(dǎo)性能性擾動的差別效應(yīng)。研發(fā)結(jié)果還標(biāo)明，氧化應(yīng)激也許在用這類不同劑量/型號的晶體解決的細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)中起首要功效[30]。

但是，理應(yīng)注重的是，COM / COD晶體的劑量及其表露于一切上述體外研發(fā)中運(yùn)用的細(xì)胞的時間也許并非完全代表結(jié)石成型劑中的體內(nèi)情況，這也許隨同著腎結(jié)石發(fā)病體制的另1個模型，即Randall的斑塊模型?，F(xiàn)在，晶體 - 細(xì)胞互相功效的體內(nèi)研發(fā)仿佛尚未用來腎結(jié)石研發(fā)，由于限定（實(shí)際上缺少）追蹤體內(nèi)晶體 - 細(xì)胞互相功效的技術(shù)。當(dāng)這類技術(shù)可用時，腎結(jié)石生成的致病體制將愈加清楚。

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3. 腎小管細(xì)胞頂端外表COM晶體受體的蛋白質(zhì)組學(xué)判定

腎結(jié)石研發(fā)在細(xì)胞程度上獲得重要飛躍的另一步是開發(fā)一類簡潔但有效的剝離方式來分離和純化極化腎小管細(xì)胞的頂膜[49]。這類新方式首要依托于所加以的外表（比如，Whatman濾紙，硝酸纖維素膜，玻璃紙或玻璃蓋玻片）的吸附本領(lǐng)，以借用這類外表和頂端膜之間的含水親和力和離子互相功效與頂端膜粘附。在測驗(yàn)的這4個外表中，濾紙是分離和純化頂端膜的最有效一類，而基底外側(cè)膜蛋白沒有任意污染，這已通過免疫印跡和免疫熒光染色證明[49]。與傳統(tǒng)的生化測定（首要應(yīng)用基于離心的方式）相比，剝離方式在分離/純化頂端膜方面要有效得多。

該剝離方式用來分離極化腎小管細(xì)胞頂膜的高度純化部份，接著判定細(xì)胞外表的潛在COM晶體受體[32]。將回收的蛋白質(zhì)重懸于人工尿液中，并和COM晶體一塊孵育過夜。洗滌和洗脫后，凝膠加強(qiáng)液相色譜法，接著串聯(lián)MS（GeLC-MS / MS）共判定出96個潛在的COM晶體受體。此中，膜聯(lián)蛋白II成為COM晶體受體的功效通過晶體-細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，接著應(yīng)用特同性抗膜聯(lián)蛋白II抗體進(jìn)行中和[32]。另外，其余COM晶體受體也在隨后的研發(fā)中獲得證明，含蓋α烯醇化酶[34，36]、膜聯(lián)蛋白A1[33，35]、熱休克蛋白90（HSP90）[37，40]和質(zhì)膜Ca2+異肽酶 2 （PMCA2） [41]。

其余不成為COM晶體受體但其功效與各類COM晶體受體有關(guān)的蛋白質(zhì)，含蓋α-微管蛋白和層粘連蛋白A / C.A-微管蛋白（一類細(xì)胞骨架蛋白）被判定為應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方式用1000μg/mL COM晶體解決的腎小管細(xì)胞中的下調(diào)蛋白質(zhì)之一[25]，并成為蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)互相功效網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)[38]].α-微管蛋白的過表示造成3種COM晶體受體的下調(diào)，含蓋α烯醇化酶、熱休克蛋白70（HSP70）和HSP90，以及細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)下落[38]。相比之下，另一項(xiàng)蛋白質(zhì)組學(xué)研發(fā)發(fā)掘，層粘連蛋白A/C（一類核層蛋白）是用100 μg/mL COM晶體解決的腎小管細(xì)胞中的上浮蛋白質(zhì)之一[24]，并成為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相功效網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)[39]。小煩擾RNA（siRNA）敲低層粘連蛋白A/C造成4種COM晶體受體（含蓋維門汀、α烯醇化酶、S100和膜聯(lián)蛋白A2）的程度減低，以及細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)下落[39]。這類信息標(biāo)明，層粘連蛋白A / C擁有各類性能，含蓋調(diào)整其余蛋白質(zhì)的表示。對上述COM晶體受體及其調(diào)整劑或有關(guān)蛋白質(zhì)的表征也許造成進(jìn)一步成長方略，通過阻斷COM晶體粘附在細(xì)胞上和晶體保留在腎內(nèi)來防范腎結(jié)石的生成。

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4. COM晶體對單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的牽連

CaOx晶體不單與腎小管細(xì)胞互相功效，還與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞互相功效，它們在進(jìn)一步加劇腎結(jié)石生成的炎癥流程中起首要功效。因而，蛋白質(zhì)組研發(fā)已然研發(fā)了單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞呼應(yīng)COM晶體的功效。將人單核細(xì)胞U937細(xì)胞與100μg/mL COM晶體一塊孵育24小時，并檢驗(yàn)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變[42]。應(yīng)用2-DE進(jìn)行深紫色熒光染色，接著進(jìn)行Q-TOF MS和MS/MS解析，結(jié)果顯現(xiàn)9種蛋白質(zhì)的程度上升，13種蛋白質(zhì)的程度減低，這類蛋白質(zhì)在細(xì)胞周期、細(xì)胞構(gòu)造、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、mRNA加工并且蛋白質(zhì)合成、安穩(wěn)和降解中的功效[42]。

起初，采取相似的方式研發(fā)人巨噬細(xì)胞與100μg/mL COM晶體互相功效24小時后細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變[43]。較為蛋白質(zhì)組解析揭露了7種上浮和7種下調(diào)蛋白質(zhì)，它們操控細(xì)胞構(gòu)造，碳水化合物代謝，DNA / RNA加工，蛋白質(zhì)代謝，分子運(yùn)輸和應(yīng)激反應(yīng)。有趣的是，蛋白-蛋白互相功效網(wǎng)絡(luò)解析標(biāo)明，HSP90直接與β肌動蛋白和α微管蛋白互相功效，一切這類互相功效的同伴在COM解決的巨噬細(xì)胞中都上浮。性能研發(fā)標(biāo)明，唯獨(dú)肌動蛋白與HSP90共定位在被吞噬的COM晶體周邊，生成吞噬體構(gòu)造。siRNA對HSP90的敲低抑止了吞噬體的生成并且COM晶體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的吞噬和遷移活性。這類信息標(biāo)明，HSP90不單成為COM晶體受體，況且在巨噬細(xì)胞的吞噬體生成和吞噬活性中也起著至關(guān)首要的功效[43]。

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5. COM晶體對排泄組和外泌體蛋白質(zhì)組的牽連

除了COM晶體誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化外，還應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方式研發(fā)了晶體 - 細(xì)胞互相功效對排泄組的牽連。針對腎小管細(xì)胞，100 μg/mL COM晶體造成2種排泄蛋白程度上升，4種排泄蛋白程度減低[13]。有趣的是，應(yīng)用先前創(chuàng)建的基于纖溶酶原-纖溶酶活性的晶體遷移測定法進(jìn)行了性能研發(fā)[50]。信息顯現(xiàn)，排泄性烯醇化酶-1的加大反過來又通過ECM督促COM晶體侵蝕和單核細(xì)胞的遷移[13]。針對人單核細(xì)胞，用U937單核細(xì)胞孵育100μg/mL COM晶體16 h可誘導(dǎo)細(xì)胞中14個排泄蛋白加大和4個減小[44]。有趣的是，一項(xiàng)免疫熒光研發(fā)探測到細(xì)胞外表的HSP90加大，這標(biāo)明其加大的排泄也許來自非經(jīng)典排泄途徑[44]。

為了證明COM能夠通過非經(jīng)典排泄途徑誘導(dǎo)排泄組的改變，隨后的研發(fā)調(diào)研了來自人類巨噬細(xì)胞的外泌體蛋白質(zhì)組的變化。應(yīng)用基于凝膠的[45]和無凝膠[46]定量蛋白質(zhì)組學(xué)方式，判定出不少顯著變化的外泌體蛋白。有趣的是，表露于COM晶體的巨噬細(xì)胞構(gòu)成更高程度的白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），這是炎癥小體活化標(biāo)注物之一[51，52]。另外，來自這類晶體互相功效巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移/活化，單核細(xì)胞構(gòu)成更高程度的白細(xì)胞介素-8（IL-8）（一類促炎細(xì)胞因子），其成為旁排泄激活巨噬細(xì)胞的吞噬活性[45]。siRNA敲低了一類上浮蛋白（維門?。?，順利地抑止了來自COM晶體表露巨噬細(xì)胞的外泌體的這類功效[45]。另外，來自這類晶體互相功效巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移，加強(qiáng)腎小管細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-8的構(gòu)成，與COM晶體的結(jié)合本領(lǐng)更強(qiáng)，并通過ECM激活晶體入侵[46]。

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6. 論斷

在過去的12年中，蛋白質(zhì)組學(xué)已順利運(yùn)用于腎結(jié)石研發(fā)，旨在更好地了解腎結(jié)石生成的致病體制，特別是在晶體 - 細(xì)胞互相功效（表 1).這類研發(fā)的第一階段首要牽扯與COM晶體互相功效后腎小管細(xì)胞中變化的全細(xì)胞蛋白質(zhì)組的表征。隨后，亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)揭露了細(xì)胞與COM晶體互相功效后線粒體蛋白質(zhì)組改變和線粒體性能阻礙的其余數(shù)據(jù)。另外，對不同劑量和型號的CaOx晶體對腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的牽連的性能研發(fā)，促使更好地解讀受晶體 - 細(xì)胞互相功效牽連的腎小管細(xì)胞的表示和性能擾動（見第2節(jié)）。在開發(fā)出一類簡潔而高效的方式來從極化的腎小管細(xì)胞中純化頂膜以后，該行業(yè)產(chǎn)生了1個較大的飛躍。特別是，蛋白質(zhì)組學(xué)判定了批量潛在的COM晶體受體，接著在隨后的幾項(xiàng)研發(fā)中進(jìn)行了性能驗(yàn)證。這類發(fā)掘針對進(jìn)一步制訂通過阻斷致病晶體與靶腎小管細(xì)胞之間的結(jié)合來防備腎結(jié)石生成的方略十分首要（見第3節(jié)）。除腎小管細(xì)胞外，蛋白質(zhì)組學(xué)還運(yùn)用于研發(fā)人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變，這類改變造成更清晰地了解解除粘擁護(hù)內(nèi)化CaOx晶體和炎癥反應(yīng)的體制（見第4節(jié)）。另外，還開發(fā)了幾種性能測定方式，以處理從蛋白質(zhì)組學(xué)研發(fā)的初始階段判定的表示信息的性能意思。比如，判定由COM晶體誘導(dǎo)的變化的排泄蛋白，這反過來又加重了通過ECM的晶體入侵。最終，較近對于巨噬細(xì)胞外泌體在腎結(jié)石生成炎癥級聯(lián)中的功效的常識供應(yīng)了額外的新數(shù)據(jù)，以更好地了解晶體 - 細(xì)胞互相功效時期的炎癥級聯(lián)反應(yīng)（見第5節(jié)）。綜上所述，一切這類發(fā)掘都有助于更好地了解腎結(jié)石病的致病體制，特別是在晶體 - 細(xì)胞互相功效的方法中。另外，這類發(fā)掘還也許造成開發(fā)新的方略來防備新的和/或復(fù)發(fā)的腎結(jié)石的生成。